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作为一种新型的PCR技术,Real-Time PCR技术将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起,与通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时观测PCR反应进行的情况,解决了传统PCR难以对扩增起始模板的量进行测定的难题,并具有快速、避免交叉污染等特点,在基因检测、基因表达、SNP分析等领域得到广泛的应用。 |
定量PCR对起始模板定量 |
应用定量PCR进行基因表达研究 |
快速、高效、高通量是应用定量PCR进行基因表达研究的特点,可在2个半小时内同时完成对多个基因的表达研究。 |
绝对定量和相对定量 |
研究者在实验中如果想要得到目的基因的绝对量,则应采用绝对定量的方法;如果只是需要知道目的基因相对与某一基因(通常是管家基因)的表达情况,则可采用相对定量的方法。 |
相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线,根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量,再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。目前更为常用的方法是2-△△Ct 方法,在该公式中,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-( Ct目的基因- Ct管家基因)对照。2-△△Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的量,而不必制作标准曲线,所以更为简便省时。但此方法要求目的基因和管家基因的扩增效率一致,然而实际情况往往并非如此。 |