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慢病毒对照

吉玛提供无关序列阴性对照慢病毒,阴性对照价格实惠

产品描述

吉玛提供无关序列阴性对照慢病毒,阴性对照价格实惠!

病毒类型 滴度 200ul 400ul 600ul 1ml
shRNA慢病毒NC对照 10^8TU/ml ¥500 ¥800 ¥1200 ¥2000
shRNA慢病毒NC对照 10^9TU/ml ¥1000 ¥1500 ¥2000 ¥3000


病毒类型 滴度 200ul 400ul 600ul 1ml
过表达慢病毒NC对照 10^8TU/ml ¥1000 ¥1800 ¥2500 ¥3880
过表达慢病毒NC对照 10^9TU/ml ¥1500 ¥2300 ¥3100 ¥4880
备注:慢病毒需要干冰件运输,除江浙沪外所有地区,需要加收¥300 运费。
下单前请务必核对订购表客户信息和订购内容无误,我们将按照订购表上的内容生产、邮寄货物,开具发票!

功能介绍与实验实例

目前,我公司慢病毒载体是以国际通用的第三代载体系统为基础,通过一定改建,构成四质粒体系。其中,转移载体(transfer vector)包含转移目的基因的慢病毒骨架及其包装产生相应基因组RNA的所有顺式作用元件,并且可以单一或多重组合的稳定或条件诱导性表达转移基因或shRNA;另外,通过三个辅助质粒,提供病毒包装所需的反式作用因子,同时采用“自我灭活”修饰,阻止子代病毒自我复制和转移,从而确保产生的慢病毒具备良好的生物安全性。 
生物安全 
1、安全性 
(1)删除了全部HIV-1的编码基因,在介导目的基因的表达时,没有任何HIV-1蛋白的表达; 
(2)对5’和3’ LTR分别进行了删除改造,5’LTR缺失U3,换上RSV enhancer/promoter,使载体的复制不再依赖Tat;3’LTR删除U3,使其不再具有启动/增强活性,成为自灭活(self-inactivating, SIN)载体; 
(3)病毒包装必需的3个蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G(代替HIV-1的Env)分别独立放置在3个质粒上(pGag/Pol、pRev、pVSV-G),且互相之间没有任何同源序列,大大降低了复制型慢病毒(RCL)的产生几率; 
(4)与MuLV等逆转录病毒载体相比,慢病毒载体的整合更偏向于宿主细胞基因组的基因表达活跃区,激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转录病毒载体低; 
(5)慢病毒载体未发现有致肿瘤活性,全世界有4千万人感染了HIV-1,发生的整合事件不计其数,但未出现一起致瘤事件,而MuLV等逆转录病毒载体有致瘤活性; 
(6)慢病毒的LTR的转录激活能力低于逆转录病毒,激活原癌基因能力也相对较低。 

2、实验室安全措施 
慢病毒载体已经被全世界许多实验室应用,没有出现过任何意外,但仍具有潜在的产生复制型慢病毒(RCL)和致癌的风险,操作者在实验中仍需要保持高度警惕。所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行,并佩戴一次性口罩和手套,尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域,避免䚧生溶胶,tip头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品,包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。每次实验后,立即清理所有接触过病毒的器具,均应高压消毒再进行下一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后,用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体,用卫生纸吸干后,用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。装盛慢病毒载体的实验用品,要单独放置,标示清楚,并标注“危险品”字样。尽量使用培养瓶,使用培养板来感染病毒,要防止意外洒落。对共用实验室的人员进行慢病毒安全培训或提示。 
成功例 

病毒滴度测定:

 



吉玛基因实验室细胞推荐Lentivirus感染参数: 


细胞系慢病毒感染参数

名称

ATCC No.

细胞类型及来源

达到80%感染所需MOI

293T CRL-11268 人胚胎肾细胞 1
95D —— 人高转移肺腺癌细胞 3
CNE-1 —— 人鼻咽癌细胞(高分化) 50
hADSC —— 人脂肪肝细胞 100
HEC-1B HTB-113 人子宫内膜癌细胞 5
Hep-2 —— 人喉表皮样癌细胞 20
hFOB1.19 —— 永生化人成骨细胞 2
HL-60 CCL-240 人原髓细胞白血病细胞 50
HLE-B3 —— 人晶状体上皮细胞 1
hMSC —— 人骨髓间充质干细胞 50
hSMC —— 人平滑肌细胞 50
HUVEC —— 人脐静脉内皮细胞 5
Jurkat TIB-152 人白血病细胞 100
MCF-7 HTB-22 人乳腺腺癌细胞 5
MDA-MB-231 HTB-26 人乳腺癌细胞 10
SaoS-2 —— 人成骨肉瘤细胞 20
SGC-7901 —— 人胃癌细胞 5
SHG-44 —— 人胶质瘤细胞 10
SKOV-3 HTB-77 人卵巢癌细胞 5
SMMC-7721 —— 人肝癌细胞 1
SPC-A-1 —— 人肺腺癌细胞 10
THP-1 TIB-202 人单核细胞 100
U251 —— 人胶质瘤细胞 1
U-20S HTB-96 人骨癌细胞 5
U937 CRL-1593.2 人组织细胞淋巴瘤细胞 100
HSC-T6 —— 永生化大鼠肝星型细胞 3
PC-12 CRL-1721 大鼠肾脏嗜铬细胞 100
H9c2(2-1) CRL-1446 大鼠心肌细胞 1
KM3 —— 大鼠骨髓癌细胞(B淋巴细胞) 50

原代培养细胞慢病毒感染参数

细胞名称 种属 细胞类型及来源 达到80%感染所需MOI
甲状旁腺原代细胞 甲状旁腺组织 50
胚椎间骨髓核细胞 胚胎组织 5
血管平滑肌细胞 大鼠 血管平滑肌 >100
胶质细胞 大鼠 脑组织0 5


培养器皿 底面积(cm2) 加培养液量(mL) 可获细胞量
96孔培养板 0.32 0.1 0.5-2.0×10^4
48孔培养板 0.8 0.2 0.2-1×10^5
24孔培养板 1.9 1.0 0.5-2×10^5
12孔培养板 3.8 2.0 1-4×10^5
6孔培养板 9.6 2.5 3-8×10^5
3.5cm培养皿 9.6 3.0 3-8×10^5
6cm培养皿 28 5.0 1-3×10^6
9cm培养皿 49 10.0 2-5×10^6
10cm培养皿 55 10.0 3-8×10^6
25cm塑料培养瓶 25 5.0 5×10^6
75cm塑料培养瓶 75 15-30 2×10^7
25cm玻璃培养瓶 19 4.0 3×10^6
100cm玻璃培养瓶 37.5 10.0 6×10^6
250cm玻璃培养瓶 78 15.0 2×10^7
2500cm旋转培养瓶 700 100-250 2.5×10^8

使用方法

Lentivirus在细胞水平使用 

GenePharma提供的重组Lentivirus颗粒是以VSV-G膜蛋白包裹,从而大大增加了病毒感染谱,但对不同组织细胞亲嗜性仍有差别,因此,有必要在使用Lentivirus颗粒之前请查阅有关文献,了解Lentivirus对靶细胞的亲嗜性、感染复数(MOI值)及体内(in vivo)注射所需的病毒量,若无相应文献支持,则需要检测病毒对靶细胞的亲嗜性。

1、病毒滴度复核(有限稀释法测定) 

(1)滴度检测前一天,对293T细胞传代,96孔板每个孔加入约5×10^4cells/ml,体积50~100ul; 
(2)第二天,准备3~5个无菌EP管,在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基(高糖DMEM+10%FBS); 
(3)取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中,轻轻混匀后,取10ul加入到第二个管中,然后依次操作直到最后一管; 
(4)选取所需的细胞孔,吸弃90ul培养液,然后将稀释好的病毒液,从低浓度到高浓度依次加入,放入37℃ 5% CO2培养箱中培养; 
(5)48小时后,每孔加入100ul新鲜培养液,小心操作,不要吹起细胞; 
(6)3~4天后,观察荧光表达情况,正常情况下,荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少,计数最后二个含有荧光细胞的孔中的荧光细胞个数,将得到的数值除以各自相应的稀释倍数,即可计算出病毒原液的滴度值(通常以倒数第二个孔中的读数值更为准确)。 

注释: 
(1)病毒滴度测定结果还依赖于本身实验系统,如293T细胞代数、细胞状态、荧光显微镜品质、相关实验试剂及实验人员操作技能,因此不同实验室测得滴度数值会有所差异(1~5倍),但基本不会影响正常实验流程; 
(2)病毒滴度(BT = TU/ml, transducing units)计算公式: TU/μl = (P × N / 100 × V) ×1/DF, P = % GFP+ cells,N = 转染时的细胞数V =每孔加入病毒稀释液体积(μl),DF =稀释因子(dilution factor)= 1 (undiluted)、10–1 (diluted 1/10)、 10–2 (diluted 1/100)。 


常用慢病毒滴度检测方法比较 


名称 原理 单位 特点 优缺点 与GFP荧光法相比
p24核心蛋白定量法 ELISA Kit 1 ng p24/ml
LP/ml
TU/ml(估计)
物理(颗粒)滴度 经典方法,简单、重复性好 高估102~103倍
RNA基因组定量法 RT-qPCR RNA/ml、 
Vg/ml
TU/ml(估计)
物理(核酸)滴度 精度高,但对仪器和操作要求高 高估102~104倍
GFP荧光计数法 FACS(流式细胞计数) TU/ml 感染滴度 经典方法,简单、重复性好 -
抗性克隆计数法 细胞克隆计数 TU/ml 感染滴度 克隆形成需约2周 低估5~10倍
Dot-blot法 RNA dot-blot RNA/ml 物理(核酸)滴度 简单,但属于半定量
DNA 定量法 感染细胞后定量载体DNA TU/ml 感染滴度 最接近真实感染滴度,但不同细胞感染效率不同


2、 靶细胞感染预实验 

(1)实验前一天分别接种3~5×103 个靶细胞于96孔培养板每孔中,所加培养基体积为100µl ,不同种类的细胞生长速度有所差异,为保证有较好的实验结果,进行病毒感染时细胞的融合率为40%~60%,因为Lentivirus表达时间较长,故在进行感染时细胞接种不宜过密; 

(2)感染预实验应分为3组,每组均有三个不同梯度的MOI值(Multiply of Infection)。第一组为正常情况下感染,即在完全培养基中直接加入病毒。第二组为感染时添加5µg/ml Polybrene,Polybrene针对多数细胞可有效提高病毒感染效率(3~6倍); 

(3)感染前为细胞换液,吸取细胞上清,按不同的分组情况加入所需的培养基90µl,每组三个孔; 

(4)准备2个无菌的EP管,在每个管中加入90ul的稀释液,吸取10ul ~20ul的1×10^8TU/ml的病毒液(预先从-80℃取出迅速融化,而后将病毒放置于4度下进行操作),依次10倍稀释,轻轻混匀,请勿产生气泡,这样既可得到三个病毒梯度:10、100及1000倍病毒稀释液;  

(5)将三个不同梯度的病毒加到每组的三个孔中,计算可知,三个孔的MOI分别为100、10、1,如果所用的病毒滴度未达到1×10^8TU/ml,则相应增加病毒体积使得能够得到不同的MOI;  

(6)把细胞板放回细胞培养箱孵育;  

(7)8~12hrs以后请观察细胞状态,如果细胞状态与未感染组无明显差异,表明lentivirus对细胞没有明显的毒性作用,请不要换液,继续培养,24h后更换为新鲜培养基培养; 
(8)感染3~4天后,观察荧光表达情况。对于生长迟缓代谢慢的细胞,可以适当延长观察时间,中途可以换液,保持细胞的良好生长状态;
(9)以上的操作是针对贴壁细胞设计的。悬浮细胞的区别主要在细胞分盘上,它不是需要提前一天分盘。操作时直接将细胞离心后悬浮在不同的培养基中,计数分盘后,即可以加入病毒; 
(10)通过首次实验和重复实验,确定目的细胞的感染方法和感染参数。结果参见如下实例。 

3、正式试验 
    通过预实验可以帮助确定使用重组Lentivirus颗粒感染目的细胞的优化条件,如细胞接种密度,是否需要添加Polybrene,合适的MOI值等参数。正式实验前,调整并保持细胞的良好状态是非常重要的。有些对Polybrene敏感,这时候就不能添加Polybrene去增强感染效率。 
    Lentivirus表达时间较长,但在一般代谢较旺盛的细胞(如293T,BHK21等)上,病毒感染24hrs后可以观察到GFP(或者RFP)荧光;代谢比较缓慢的细胞(如原代培养细胞,神经干细胞,胚胎干细胞等)GFP(或者RFP)蛋白表达时间较长,感染后72-96hrs甚至更长时间才可以观察到GFP(或者RFP)荧光。感染后的细胞可以连续培养一周,通过观察GFP(或者RFP)的表达时间和表达强度来确定Lentivirus对目的细胞的感染情况。感染后期请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液和传代,以保证细胞良好的生长状态。 

运输和储存 

  对于长距离运输,应先将慢病毒载体保存在-80℃,再采用全程干冰运输,以防滴度下降。 慢病毒载体在-80℃保存6个月,滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品,进行实验前,重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融(小于3次)。 使用前从-80℃取出病毒,立即放在37℃水浴锅中,轻轻晃动,使其尽快溶解,操作过程应置于冰盒上进行。用不完的病毒可以暂时放在4℃冰箱中,但最好尽快用完。 

常见问题及解决方案: 

1.Q:通常在转移载体中最大能够插入多大的目的基因序列?  
 A:基于HIV基因骨架的原因,通常插入的目的基因序列要小于4kb,否则会影响病毒滴度甚至基因表达。 

2.Q:Lentivirus对目的细胞的感染效率很低,如何提高病毒的感染效率? 
 A:一般,我们通过提高MOI值来提高病毒的转染效率,必要时以在培养基中加入Polybrene(4~8µg/ml)来提高病毒的感染效率。同时,目的细胞良好的生长状态是获得正常感染效率的保证。 


3.Q;lentiviirus感染,但是GFP荧光强度很弱,为什么? 

 A:中GFP荧光强度取决于病毒感染细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型以及观察时间等。一般来讲,目的细胞感染病毒颗粒数越多,细胞本身增殖越快,GFP荧光会越强。Lentivirus属于慢病毒,一般在增殖较快的细胞中病毒感染72~96h后,GFP基因表达才达到高峰。对于增殖较慢的细胞,GFP基因表达时间还会延长。 


4.Q:感染病毒后,目的细胞死亡很厉害,为什么? 
  A:lentivirus可能对您的目的细胞有一定的毒性,请调整并降低感染的MOI值,并且在4hrs,8hrs或者12hrs后对细胞进行换液,用新鲜的完全培养液继续培养观察。



产品说明书

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