公司产品

siRNA转染试剂

siRNA mate plus、GP-transfect-Mate等多款转染试剂,可满足客户多种实验需求

产品描述

RNA干扰技术已经成为研究基因功能的有力工具。任何一个RNA实验的成功都有赖于:

1. 高质量的siRNA(或shRNA表达载体) 

2. 有效的转染方法

目前哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
阳离子脂质体转染试剂的选择对于利用siRNA介导的基因沉默实验来说同样是至关重要的。没有高效的转染,就不能有效的引发相应的细胞响应,会直接影响同一siRNA的抑制效果。只有将siRNA高效转染哺乳动物细胞,才能更真实的检测siRNA干扰基因表达的效果。
如何选择最适合的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。转染试剂推荐使用GenePharma的转染试剂—GP-transfect-Mate


GenePharma的转染试剂


siRNA-Mate plus 转染试剂盒(siRNA/miRNA通用型)是一种新型即用型脂质纳米转染试剂,适用于多种细胞类型的siRNAmiRNAmimics/inhibitor转染,包括贴壁或悬浮的多种细胞。

易用:一步即可实现siRNA/miRNA高效包封,无需孵育,无需更换培养基。

高效:通过细胞内源性转运机制实现转染,复合物室温稳定长达8小时,更适于高通量筛选。

细胞零压力:本品不含乙醇,采用生物可降解脂质材料对细胞影响极小。


GP-transfect-Mate是吉玛基因最新推出的一种高效能高分子聚合物转染试剂,应用于多种细胞的DNA质粒以及siRNA、miRNA oligo的体外转染实验。基于该聚合物结构分布一致性高,具有能够快速、均一性携带RNA或DNA等核酸物质复合能力,故可实观良好的重复性、均一性、低毒性的转染效果。与其它转染试剂比较,GP-transfect-Mate转染效率高、细胞存活率高、毒性小。可广泛用于瞬时和相对稳定转染,有助于蛋白表达和基因功能的研究。


应用领域:

1、贴壁细胞和悬浮细胞转染。
2、部分原代细胞和转化细胞株的基因转染 。
3、DNA转染;DNA和siRNA的共转染。
4、siRNA高通量转染试验。
5、核酸(siRNA、DNA、RNA)的体内导入试验。

特点:

1、不必更换培养基,操作简便易行,重复性好可在半小时内完成操作。
2、介导siRNA高转染细胞和体内高效导入
3、在含血清培养基中也能表现高转染效率
4、可在室温下运输,在4℃下可长期保存
5、细胞毒性低
6、适用细胞广泛;即用型试剂,可在含有抗生素的完全培养基中转染,操作格外简单方便。
7、专门用于转染,确保没有RNAse活性

目录号 产品名称 规格 价格 交货期限
G04001 RNAi-Mate转染试剂 0.1ml ¥150 2个工作日
G04026 siRNA-Mate plus转染试剂 0.1ml ¥150 2个工作日


G04008 GP-transfect-Mate 0.1ml ¥150 2个工作日
G04009 GP-transfect-Mate 1ml ¥1,500 2个工作日

*本产品仅限于科研用途,而不适用于临床诊断、治疗等其他特殊用途。


功能介绍与实验实例

产品介绍 

siRNA-mate plus转染试剂盒(siRNA/miRNA通用型)是基于先进的脂质纳米粒核心技术专为小片段RNA开发的全新一代转染试剂。
先进的脂质纳米粒(LNP)技术:这款试剂以LNP技术为核心,相比传统阳离子脂质体转染试剂具有显著优势;
即时组装的siRNA-NeoLNP复合物:依托领先的LNP技术平台,无需乙醇即可实现与专业包封设备相当的包封效果;
高效的细胞内递送:LNP独特的跨膜转运和内体逃逸机制,实现高效递送,释放siRNA基因静默潜力;
细胞零压力:采用的生物可降解、新型可电离脂质材料,进入细胞后将迅速代谢,且不含乙醇,对细胞的影响极小;
适用细胞种类广泛:无惧不同培养基条件的挑战。


GP-transfect-Mate转染效率高、细胞存活率高、毒性小。可广泛用于瞬时和稳定转染,也可以应用于蛋白表达和基因功能的研究。 
转染试剂保存在 4℃,有效期1年。

重要提示

细胞的状态:转染时贴壁细胞的密度以 50%左右为佳,而且转染时细胞应处在生长旺盛的对数生长期。细胞密度过高和细胞传代数过高会影响转染效果。


siRNA
的质量:使用高纯度的siRNA也是转染成功的关键。在转染前需确定siRNA的含量和纯度,实验过程中需要使用DEPC处理过的耗材和试剂,注意避免RNAse污染。

血清的影响:在制备 siRNA-mate/GP-transfect-Mate  和 siRNA 形成复合体过程中不能添加血清,血清会影响复合体形成,建议用OPTI-MEM 或其他无血清培养基(如 DMEM、RPMI-1640 等)稀释 siRNA 和转染试剂,以达到复合物形成的最佳效果。但是,在随后的转染过程中,血清的存在并不影响复合体的转染效果。使用GP-transfect-Mate 进行转染时,多数情况下,在完全培养基中进行转染,并且转染后不更换培养基有助于获得更高的转染效率和更低的细胞毒性。

转染试剂的用量:对于一定量的siRNA建议尝试按照推荐剂量的转染试剂进行优化,以确定最佳的转染效率。

GP-transfect-Mate 案例

NA oligo

CAFs


A375


DNA质粒载体

NE-4C

\\\

MGC803

\\\

使用方法

转染的一般性指导

siRNA浓度和用量的一般换算:1OD≈33ug≈2.5nmol  1OD125ul的水,得到20uM的浓度。1ul就是20pmol,在1ml细胞培养液中加1ul20pmol),那终浓度就是20pmol/ml=20nM。加2ul就是40nM,以此类推。如果按ug计算,1OD125ug水溶解后,质量浓度为 33ug/125ul=0.264ug/ul。

siRNA影响基因阻断水平 (Gene Knockdown Level)的因素:
1、转染效率
2、目的基因转录效率
3、蛋白质稳定性
4、siRNA序列的有效性
5、所选择哺乳动物细胞系的生长特征

siRNA-mate plus转染试剂盒(siRNA/miRNA通用型)细胞转染操作流程
(以24孔板单孔转染15pmol siRNA为例,不考虑移液损耗)

细胞铺板
转染实验前一天,用胰蛋白酶消化,调整细胞浓度并计数。将细胞在24孔板中铺板,置于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜。实验当天转染时的细胞汇合度达到60% 左右时进行转染为佳。建议通过预实验确定不同细胞的最佳转染密度。
siRNA预混液制备

取Buffer 8.5μL置于无菌无酶EP管中,加入15pmol siRNA(若siRNA原液浓度20μM,取0.75μL),吹打混匀,即得 siRNA预混液。
注:请确保siRNA原液的溶剂为无酶水,且浓度不低于10μM。
不得使用PBS或培养基稀释siRNA原液,请确保稀释得到的siRNA预混液浓度为1.5pmol/μL(1.5μM)左右。
siRNA/plus复合物制备
向上述EP管中,每管siRNA预混液加入1.5μL(或3μL)plus转染试剂,立即用移液枪吹打数十次进行混匀,即得siRNA/plus复合物。
注:siRNA/plus复合物尽快加入到细胞中。如特殊情况,在室温条件下存放不要超过8小时,请勿将siRNA/plus复合物置于冷冻条件。
加样
将制得的siRNA/plus复合物加至细胞中,轻轻晃动24孔板使分散均匀(前后和左右方向各晃动十多次)。放回培养箱中培养,根据实验安排进行后续实验。
注:培养基是完培,可以含有双抗和血清
检测
转染后24、48小时两个时间点检测基因水平变化,48、72小时检测蛋白水平变化。不同基因的半衰期是不同的,siRNA干扰是抛物线形的,多做几个时间点有利于siRNA干扰效果的测定

适用范围

siRNA- mate plus 转染试剂盒(siRNA/miRNA通用型)适用于绝大多数真核细胞siRNA/miRNA体外转染。
本产品仅供研究使用。

运输和保存
常温运输。2℃~8℃保存,有效期一年。不得冷冻!

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使用GP-transfect-Mate  转染RNA Oligo进入哺乳动物细胞时,遵从以下一般性指导:


为了获得最佳基因阻断结果,每一种细胞系转染siRNA或miRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系,推荐尝试使用几个 转染试剂-Mate的浓度,并在1-100nM范围内改变siRNA或miRNA的浓度,以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的siRNA或miRNA可能具有细胞系依赖性。

推荐在50%z左右细胞汇合度时进行转染。通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞可以使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。 GP-transfect-Mate 极低的细胞毒性可以方便研究者根据目的细胞生长特性,靶基因的表达特性,选择适合条件进行转染。

通过合适的FAM-NC、阳性对照优化转染和检测条件。可以使用吉玛荧光标记的阴性对照序列(根据目的RNA oligo类型,请选择对应的对照。Cat. No. A07001, B04004, B04005, B04006)帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件,推荐在每一次实验都包括荧光标记的阴性对照序列,作为转染效率的指示剂。对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照(Cat. No. A08005, A08008)。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA),转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

避免RNA酶污染。微量的RNA酶将导致siRNA/miRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品。因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。尤其直接接触Oligo原液的枪头、Tube,请务必保证RNase free。我们推荐商业化的RNase free的枪头及Tubes。

健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性。通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。

目的检测时间点。细胞转染后,不同细胞和RNA效率存在差异。一般来说,在mRNA水平观察RNAi效果的最佳时间是转染后24-48小时,在蛋白水平观察RNAi效果的最佳时间是转染后48-72小时。siRNA干扰是抛物线形的,不同基因的半衰期是不同的,多做几个时间点有利于siRNA干扰效果的测定。

转染操作注意:将siRNA/miRNA oligo—GP-transfect-Mate复合物逐滴均匀滴加到每一个包含细胞和培养基的孔中。均匀滴加后可以轻轻地前后摇动培养板混合均匀。



需要准备的材料

开始实验前准备下列试剂:

目的哺乳动物细胞系(使用传代数低的细胞;转染前确信细胞健康和超过90%的存活率)

目的siRNA或者miRNA Oligo(吉玛推荐溶解至20μM储液)

 GP-transfect-Mate  (使用前贮存在+4℃)

培养基(使用前37℃预热)

合适的细胞培养板及其它

GP-transfect-Mate 操作流程(24 孔板)

24 孔板为例,若要检测基因沉默或者过表达效果,推荐最低RNA oligo终浓度为50nM ,(DNA为0.5~1.5μg);遵循以下操作方法可以高效地将RNA  oligo或者DNA转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。但是对某些特殊的细胞系和培养条件,或特殊应用等,也需要单独特别优化,请参考表 1、表2。

1. 细胞铺板

转染时细胞密度:一般来说,当细胞密度达到60%80%时进行转染可以取得较高的转染效率(参见表1)。然而,不同细胞的最适转染密度都不尽相同,因此在初次转染某种细胞时,可以通过预实验先确认该细胞最佳的转染密度。

2. 转染复合物的制备

1)将 GP-transfect-Mate转染试剂放置于室温中,使用前轻轻混匀。

2)在1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基或 OPTI-MEM,并添加适量的转染试剂(参见表2),用移液器轻轻混匀,室温静置5 min

3)同时在另一1.5 ml无菌离心管中加入50 μl无血清培养基或 OPTI-MEM,并添加适量的RNA oligo/DNA (参见表2),用移液器轻轻混匀,室温静置5 min

4)将GP-transfect-Mate-培养基混合物滴加至RNA oligo/DNA-培养基混合物中,用移液器轻轻混匀,室温静置15-20 min 后,立即转染。

注:复合物尽量在60 min内使用,并且GP-transfect-Mate-培养基混合物和RNA oligo/DNA-培养基混合物的混合次序非常重要,切勿颠倒。

3. 转染过程

1)趁静置时,给 24 孔板换液,每孔换上 0.4ml 预热的新鲜培养基。

2)将 100 µl 转染混合物加入孔中,终体系为500 µl。加完后将板轻轻晃动以使复合物均匀分布。

337℃静置培养细胞,4-6h换成完全培养基。24-72 h检测mRNA表达,48-96 h检测蛋白表达。

适用范围

293T, A549, Beas-2B,HeLa,ECA-109,Raw264.7,A375,CAFs,HCT116,HT29,LMH,NE-4C,MGC803,PC-3, PC-12MCF-7,C6等细胞。

 1: 贴壁细胞或悬浮细胞接种数量、培养基体积

培养器皿

每孔表面积(cm2

每孔培养基的体积(ml

贴壁细胞转染前一天接种密度

悬浮细胞转染当天接种密度

96 孔板

0.3

0.1

5 000±2 500

2-5×104

24 孔板

2

0.5

25000±10 000

1-2.5×105

12 孔板

4

1

50000±20 000

2-5×105

孔板

10

2

150000±50 000

0.4-1×106

60mm

20

4

400000±100 000

1-2.5×106

100mm

60

10

1*106±250 000

2-5×106

注:贴壁细胞培养密度取决于培养器皿的表面积,而悬浮细胞则由培养基的体积决定。


 2 不同培养板转染DNA/RNA  oligo的推荐转染条件

培养器皿

Growth

Medium

Opti-MEM/ Serum-free Mediumfor complex

DNA 转染

RNA转染

DNA/μg

转染试剂/μl

RNA/pmol

转染试剂/μl

96 孔板

100 μl

2×10μl

0.2

0.4-1

20

0.5-1

24 孔板

500 μl

2×50μl

0.6

1.2-3

40

1-3

12 孔板

1ml

2×100μl

1.5

3-6

80

3-5

孔板

2 ml

2×200 μl

3

6-12.5

150

5-8

60mm

5ml

2×500 μl

6-10

12-20

300

10-20

100mm

10 ml

2×1ml

15-30

30-60

500

25-35

注:GP-transfect-Mate转染试剂的用量在此范围内进行优化。


产品说明书

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目录分类 本商品目录中的产品介绍按以下内容分类:

1. RNA干扰研究工具
2. MicroRNA研究工具 

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